img_8831.jpgNext generation sequencer gene analysis... img_7564.jpgUltra-thin section (TEM sample) img_8834_20190703125010462.jpgNext generation sequencer gene analysis... img_8552.jpgMounting sample for SEM... img_4165_1024.png img_4170.pngNext generation sequencer gene analysis... cultures_20190703125011620.png img_8382.jpgSuper-resolution microscope observation... img_4155.pngUltra micotome... img_4283.png img_4157.png img_8681.jpg img_8263.jpgTransmission electron microscope observation... ngsanalitescreensnapz003.pngNext generation sequencer gene analysis... img_7349.jpgMaking sample for sorting... img_4161.png img_8832.jpg img_8804.jpgTime lapse observation (BZ-9000) img_5700.jpgSEM sample... img_5708.jpgScanning electron microscope observation... img_8837.jpgNext generation sequencer gene analysis...

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精巣を用いた成体型幹細胞研究のメリット

精巣の細胞は分裂しても細胞間橋で繋がっており、繋がっている細胞の数を数えることにより、最初の1個目の幹細胞からの分裂回数を簡単に知ることができるのが最大の特徴です。また、体外での幹細胞の長期培養、幹細胞活性を測定するための精細管移植法なども樹立されており、組織学的検索も完成されており、様々な解析手法からアプローチできる細胞系譜です。これらのメリットを生かして研究を行っています。他の教室であまり行われていない手法として、電子顕微鏡、超解像顕微鏡を用いて超解像度の解析も行っています。

 
 

エピジェネティクス・チェックポイントの発見

私どもは、精巣の幹細胞が体細胞分裂を行いながら細胞数を増幅しているステップで、かつ、幹細胞活性を失う時期に一致して、DNAメチル化酵素の発現やH3K9me2に代表される抑制性ヒストン修飾など、大きなゲノム修飾の変化が同時に起こる変換点(エピジェネティック・チェックポイントと名付けました。)を見出しました。さらに維持DNAメチル化を障害させるためにUHRF1(Np95)のノックアウトマウスの精巣を解析したところチェックポイントまでの細胞は障害無く生存し、チェックポイント以降の細胞は消失していました。これらの研究は、ゲノム修飾酵素のノックアウトマウスを中心に、レーザー共焦点顕微鏡を用いた蛍光免疫染色にて、核内の構造、核内蛋白の位置取りを詳細に解析し、さらにセルソーターを用いて高度に純化した精巣の幹細胞、前駆細胞分画を用いた分子生物学的解析の結果明らかとなりました。このチェックポイントは、これまで40年以上信じられていた最初の一個のみが幹細胞であるという定説の場所よりもっと後の分裂段階であり、本当の幹細胞活性喪失時期は、このチェックポイントにあるのではないか、と考えています。

 
 

Stem Cell Pool説

私達は、このチェックポイントに至る前の細胞群はゲノム修飾の視点からほぼ均一な集団ではないかと考え、Stem cell pool説を提唱しています。実際、幹細胞特異的分子は最初の一個の細胞だけでなく、数回分裂した後まで発現しているものがほとんどですし、2個や4個の細胞の鎖がちぎれることも証明されており、チェックポイントまで幹細胞活性を維持している可能性が高いと思われます。さらにこのチェックポイントでのゲノム修飾を人為的に変化させることにより、幹細胞分化が制御できないか挑戦しています。

 

 

ゲノム修飾の次世代シークエンサーを用いた解析

私どもの見つけたゲノム修飾の変換点において、具体的にゲノムのどの領域がDNAメチル化、DNAハイドロキシメチル化、ヒストンメチル化などの修飾を受けるのか,次世代シークエンサーを用いて明らかにしつつあります。そして、Bisulfite法をベースとした1塩基対レベルでのDNAメチル化解析や、ChIP sequence法を用いたゲノム修飾の変化を通して、これまで観察してきた幹細胞や前駆細胞の核の形態の特徴や、RNA sequenceによる遺伝子発現パターンの差にどのような意味を与えているのか、それが幹細胞分化に具体的にどのような分子機構で影響を与えているのかを明らかにしていっています。

 

 

Development 145 (2018)

Kmt2b conveys monovalent and bivalent H3K4me3 in spermatogonial stem cells at germline and embryonic promoters.

Tomizawa S, Kobayashi Y, Shirakawa T, Watanabe K, Mizoguchi K, Hoshi I, Nakajima K, Nakabayashi J, Singh S, Dahl A, Alexopoulou D, Seki M, Suzuki Y, Royo H, Peters AHFM, Anastassiadis K, Stewart AF, Ohbo K

Mol Cell Biol. 37(19): e00082-17 (2017)

EPC1/TIP60-Mediated Histone Acetylation Facilitates Spermiogenesis in Mice.

Dong Y, Isono KI, Ohbo K, Endo TA, Ohara O, Maekawa M, Toyama Y, Ito C, Toshimori K, Helin K, Ogonuki N, Inoue K, Ogura A, Yamagata K, Kitabayashi I, Koseki H.

Epigenetics & Chromatin 10: 25-44 (2017)

Transcription and chromatin determinants of de novo DNA methylation timing in oocytes

Gahurova L*, Tomizawa S*, Smallwood SA, Stewart-Morgan KR, Saadeh H, Kim J, Andrews S, Chen T, Kelsey G *Contributed equally

GENES & DEVELOPMENT 29(23):2449-2462 (2015)

Dynamic changes in histone modifications precede de novo DNA methylation in oocytes

Kathleen R. Stewart, Lenka Veselovska, Jeesun Kim, Jiahao Huang, Heba Saadeh, Shin-ichi Tomizawa, Sébastien A. Smallwood, Taiping Chen, and Gavin Kelsey

Genome Biology 16: 209-215 (2015)

Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape.

Lenka Veselovska, Sebastien A. Smallwood, ... Shin-ichi Tomizawa4, Simon Andrews and Gavin Kelsey*

BioMol Concepts 6(1): 1–9 2015

Epigenetic regulation in stem cell development, cell fate conversion, and reprogramming.

Kazuyuki Ohbo and Shin-ichi Tomizawa

BMC Genomics 16:624-40 2015

DNA methylation and gene expression dynamics during spermatogonial stem cell differentiation in the early postnatal mouse testis.

Naoki Kubo, ……., Takayuki Shirakawa, Hidetoshi Sone, Yasuyuki Sato, Shin-ichi Tomizawa, Kazuyuki Ohbo

Biological Research. 48:48-62 2015

Inhibition of Rho-associated kinases disturbs the collective cell migration of stratified TE-10 cells.

Taro Mikami, Keiichiro Yoshida, Hajime Sawada, Michiyo Esaki, Kazunori Yasumura and Michio Ono

Dev Cell., 34: 1-12 2015

The RNA binding protein Nanos2 organizes a post-transcriptional buffering system to retain primitive state of mouse spermatogonial stem cells.

Zhou, Z., Shirakawa, T., Ohbo, K., Sada, A., Wu, Q., Hasegawa, K., Saba, R. and Saga, Y.

Curr. Pathobiol. Rep., 2:1-9 2014

Stem Cell Epigenetics: Insights from Studies on Embryonic, Induced Pluripotent, and Germline Stem Cells.

Shin-ichi Tomizawa, Takayuki Shirakawa, Kazuyuki Ohbo

Development, 140:3565-3576. 2013

An epigenetic checkpoint controls the transition from a stem cell pool to a progenitor cell state in mouse male germ cells.

Shirakawa T., Yaman-Deveci R., Tomizawa S., Kamizato Y., Nakajima K., at.,al.

Cell Biochem. Func 30(1), 33-40 2012

Plasmodium induced by SU6656, an Src family kinase inhibitor, is accompanied by a contractile ring defect.

Yoshida K, Ono M, Bito H, Mikami T, Sawada H

The International journal of developmental biology 56 867-875 2012

DNA methylation establishment during oocyte growth: mechanisms and significance.

Tomizawa S, Nowacka-Woszuk J, Kelsey G

Nature genetics 43 811-814 2011

Dynamic CpG island methylation landscape in oocytes and preimplantation embryos.

Smallwood SA, Tomizawa S, Krueger F, Ruf N, Carli N, Segonds-Pichon A, Sato S, Hata K, Andrews SR, Kelsey G

Development, 138:4207-4217. 2011

HP1γ links histone methylation marks to meiotic synapsis in mice.

Takada Y., Naruse C., Costa Y., Shirakawa S., Tachibana M., Sharif J., Kezuka-Shiotani F., Kakiuchi D., Masumoto H., Shinkai Y., Ohbo K., Peters A. H.F.M., Turner J. M.A., Asano M. and Koseki K.

Development 138 811-820 2011

Dynamic stage-specific changes in imprinted differentially methylated regions during early mammalian development and prevalence of non-CpG methylation in oocytes.

Tomizawa S, Kobayashi H, Watanabe T, Andrews S, Hata K, Kelsey G, Sasaki H

大保 和之

教授

富澤 信一

講師

尾野 道男

助教

黒羽 一誠

助教

中島 久仁子

技術員

星 郁栄

技術員

小林 裕貴

博士課程3年

南澤 恵佑

博士課程1年

夏目 幸治

修士課程2年

溝口 敬太

修士課程2年

Uros Radvic

修士課程2年

Selma Dizdarevic

修士課程1年

前川 友紀

卒研生(4年生)

星 美希

医学部生

精巣の細胞は体外での幹細胞の長期培養、幹細胞活性を測定するための精細管移植法なども樹立されており、組織学的検索も完成されており、様々な解析手法からアプローチできる細胞系譜です。これらのメリットを生かして研究を行っています。他の教室であまり行われていない手法として、電子顕微鏡、超解像顕微鏡を用いて超解像度の解析も行っています。

  • ゲノム修飾(エピジェネティクス)による幹細胞の運命決定制御機構の解析
  • 幹細胞の増殖制御とニッチ形成機構の解明
  • 肺上皮障害の発症機構の解析

 研究室見学、大学院入学など、当研究室に関するお問い合わせは
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アウトライン

教室名

横浜市立大学医学部組織学

住所

横浜市金沢区福浦3−9

教授

大保 和之

専門

解剖学、組織学、エピジェネティクス、生殖細胞、細胞生物学など

技術

電子顕微鏡、超解像度顕微鏡、遺伝子解析など

教室員

教員4名、職員等4名